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    山東化學(xué)化工學(xué)會(huì)

    內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法

    瀏覽次數(shù): 342   發(fā)布時(shí)間:2017-06-29 14:25:27   發(fā)布人:editor

       一、內(nèi)標(biāo)法

      什么叫內(nèi)標(biāo)法?怎樣選擇內(nèi)標(biāo)物?

      內(nèi)標(biāo)法是一種間接或相對(duì)的校準(zhǔn)方法。在分析測(cè)定樣品中某組分含量時(shí),加入一種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)以校誰(shuí)和消除出于操作條件的波動(dòng)而對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生的影響,以提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。

      內(nèi)標(biāo)法在氣相色譜定量分析中是一種重要的技術(shù)。使用內(nèi)標(biāo)法時(shí),在樣品中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),它可被色譜拄所分離,又不受試樣中其它組分峰的干擾,只要測(cè)定內(nèi)標(biāo)物和待測(cè)組分的峰面積與相對(duì)響應(yīng)值,即可求出待測(cè)組分在樣品中的百分含量。采用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí),內(nèi)標(biāo)物的選擇是一項(xiàng)十分重要的工作。理想地說(shuō),內(nèi)標(biāo)物應(yīng)當(dāng)是一個(gè)能得到純樣的己知化合物,這樣它能以準(zhǔn)確、已知的量加到樣品中去,它應(yīng)當(dāng)和被分析的樣品組分有基本相同或盡可能一致的物理化學(xué)性質(zhì)(如化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性、揮發(fā)度及在溶劑中的溶解度等)、色譜行為和響應(yīng)特征,最好是被分析物質(zhì)的一個(gè)同系物。當(dāng)然,在色譜分析條什下,內(nèi)標(biāo)物必須能與樣品中各組分充分分離。需要指出的是,在少數(shù)情況下,分析人員可能比較關(guān)心化臺(tái)物在一個(gè)復(fù)雜過(guò)程中所得到的回收率,此時(shí),他可以使用一種在這種過(guò)程中很容易被完全回收的化臺(tái)物作內(nèi)標(biāo),來(lái)測(cè)定感興趣化合物的百分回收率,而不必遵循以上所說(shuō)的選擇原則。

      在使用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí),有哪些因素會(huì)影響內(nèi)標(biāo)和被測(cè)組分的峰高或峰面積的比值?

      影響內(nèi)標(biāo)和被測(cè)組分峰高或峰面積比值的因素主要有化學(xué)方面的、色譜方面的和儀器方面的三類。

      由化學(xué)方面的原因產(chǎn)生的面積比的變化常常在分析重復(fù)樣品時(shí)出現(xiàn)。

      化學(xué)方面的因素包括:

      1、內(nèi)標(biāo)物在樣品里混合不好;

      2、內(nèi)標(biāo)物和樣品組分之間發(fā)生反應(yīng),

      3、內(nèi)標(biāo)物純度可變等。

      對(duì)于一個(gè)比較成熟的方法來(lái)說(shuō),色譜方面的問(wèn)題發(fā)生的可能性更大一些,色譜上常見的一些問(wèn)題(如滲漏)對(duì)絕對(duì)面積的影響比較大,對(duì)面積比的影響則要小一些,但如果絕對(duì)面積的變化已大到足以使面積比發(fā)生顯著變化的程度,那么一定有某個(gè)重要的色譜問(wèn)題存在,比如進(jìn)樣量改變太大,樣品組分濃度和內(nèi)標(biāo)濃度之間有很大的差別,檢測(cè)器非線性等。進(jìn)樣量應(yīng)足夠小并保持不變,這樣才不致于造成檢測(cè)器和積分裝置飽和。如果認(rèn)為方法比較可靠,而色譜固看來(lái)也是正常的話,應(yīng)著重檢查積分裝置和設(shè)置、斜率和峰寬定位。對(duì)積分裝置發(fā)生懷疑的最有力的證據(jù)是:面積比可變,而峰高比保持相對(duì)恒定,

      在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)注意什么?

      在用內(nèi)標(biāo)法做色話定量分析時(shí),先配制一定重量比的被測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)樣品的混合物做色譜分析,測(cè)量峰面積,做重量比和面積比的關(guān)系曲線,此曲線即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。在實(shí)際樣品分析時(shí)所采用的色譜條件應(yīng)盡可能與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)所用的條件一致,因此,在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí),不僅要注明色譜條件(如固定相、柱溫、載氣流速等),還應(yīng)注明進(jìn)樣體積和內(nèi)標(biāo)物濃度。在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí),各點(diǎn)并不完全落在直線上,此時(shí)應(yīng)求出面積比和重量比的比值與其平均位的標(biāo)準(zhǔn)偏差,在使用過(guò)程中應(yīng)定期進(jìn)行單點(diǎn)校正,若所得值與平均值的偏差小于2,曲線仍可使用,若大于2,則應(yīng)重作曲線,如果曲線在鉸短時(shí)期內(nèi)即產(chǎn)生變動(dòng),則不宜使用內(nèi)標(biāo)法定量。

      二、外標(biāo)法

      用待測(cè)組分的純品作對(duì)照物質(zhì),以對(duì)照物質(zhì)和樣品中待測(cè)組分的響應(yīng)信號(hào)相比較進(jìn)行定量的方法稱為外標(biāo)法。此法可分為工作曲線法及外標(biāo)一點(diǎn)法等。工作曲線法是用對(duì)照物質(zhì)配制一系列濃度的對(duì)照品溶液確定工作曲線,求出斜率、截距。在完全相同的條件下,準(zhǔn)確進(jìn)樣與對(duì)照品溶液相同體積的樣品溶液,根據(jù)待測(cè)組分的信號(hào),從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度,或用回歸方程計(jì)算,工作曲線法也可以用外標(biāo)二點(diǎn)法代替。通常截距應(yīng)為零,若不等于零說(shuō)明存在系統(tǒng)誤差。工作曲線的截距為零時(shí),可用外標(biāo)一點(diǎn)法(直接比較法)定量。

      外標(biāo)一點(diǎn)法是用一種濃度的對(duì)照品溶液對(duì)比測(cè)定樣品溶液中i組分的含量。將對(duì)照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進(jìn)樣,測(cè)得峰面積的平均值,用下式計(jì)算樣品中i組分的量:

      W=A(W)/(A)

      式中W與A分別代表在樣品溶液進(jìn)樣體積中所含i組分的重量及相應(yīng)的峰面積。(W)及

      (A)分別代表在對(duì)照品溶液進(jìn)樣體積中含純品i組分的重量及相應(yīng)峰面積。外標(biāo)法方法簡(jiǎn)便,不需用校正因子,不論樣品中其他組分是否出峰,均可對(duì)待測(cè)組分定量。但此法的準(zhǔn)確性受進(jìn)樣重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定性的影響。此外,為了降低外標(biāo)一點(diǎn)法的實(shí)驗(yàn)誤差,應(yīng)盡量使配制的對(duì)照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度相近。

      外標(biāo)法 external standard method 色譜分析中的一種定量方法,它不是把標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加入到被測(cè)樣品中,而是在與被測(cè)樣品相同的色譜條件下單獨(dú)測(cè)定,把得到的色譜峰面積與被測(cè)組分的色譜峰面積進(jìn)行比較求得被測(cè)組分的含量。外標(biāo)物與被測(cè)組分同為一種物質(zhì)但要求它有一定的純度,分析時(shí)外標(biāo)物的濃度應(yīng)與被測(cè)物濃度相接近,以利于定量分析的準(zhǔn)確性。

      三、定量分析中怎樣選擇內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法(來(lái)源:藥物分析網(wǎng))

      選一與欲測(cè)組分相近但能完全分離的組分做內(nèi)標(biāo)物(當(dāng)然是樣品中沒有的組分),然后配制欲測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)樣得相對(duì)校正因子。再將內(nèi)標(biāo)物加入欲測(cè)組分的樣品中,進(jìn)樣后測(cè)得欲測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的定量參數(shù)。用內(nèi)標(biāo)法公式計(jì)算即可。

      內(nèi)標(biāo)法是將一定量的純物質(zhì)作內(nèi)標(biāo)物,加入到準(zhǔn)確稱量的試樣中,根據(jù)被測(cè)試樣和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量比及其相應(yīng)的色譜峰面積之比,來(lái)計(jì)算被測(cè)組分的含量。選擇內(nèi)標(biāo)物有4個(gè)要求:1.內(nèi)標(biāo)物應(yīng)是該試樣中不存在的純物質(zhì);2.它必須完全溶于試樣中,并與試樣中各組分的色譜峰能完全分離;3.加入內(nèi)標(biāo)物的量應(yīng)接近于被測(cè)組分;4.色譜峰的位置應(yīng)與被測(cè)組分的色譜峰的位置相近,或在幾個(gè)被測(cè)組分色譜峰中間。內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)是測(cè)定的結(jié)果較為準(zhǔn)確,由于通過(guò)測(cè)量?jī)?nèi)標(biāo)物及被測(cè)組分的峰面積的相對(duì)值來(lái)進(jìn)行計(jì)算的,因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差。內(nèi)標(biāo)法的缺點(diǎn)是操作程序較為麻煩,每次分析時(shí)內(nèi)標(biāo)物和試樣都要準(zhǔn)確稱量,有時(shí)尋找合適的內(nèi)標(biāo)物也有困難。外標(biāo)法簡(jiǎn)便,但進(jìn)樣量要求十分準(zhǔn)確,要嚴(yán)格控制在與標(biāo)準(zhǔn)物相同的操作條件下進(jìn)行,否則造成分析誤差,得不到準(zhǔn)確的測(cè)量結(jié)果。

      內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)都是定量的一種方法而已,至于哪一種方法好與不好不能一概而論,做不同的分析,面對(duì)著不同的要求,再加上分析成本分析效率等等問(wèn)題,我想簡(jiǎn)單而有效進(jìn)行定量分析來(lái)滿足要求才是最重要的。

      1、以前做過(guò)很多醫(yī)藥、農(nóng)藥中間體的芳香族鹵代化合物的常量定量分析,沒有自動(dòng)進(jìn)樣器,用外標(biāo)法定量,確實(shí)重現(xiàn)性與穩(wěn)定性非常差,結(jié)果經(jīng)常受到搞合成同事的質(zhì)疑。其實(shí),仔細(xì)分析原因不一定就是外標(biāo)法不適合這種定量分析,首先我們的實(shí)驗(yàn)室儀器和手段是否調(diào)整到一種穩(wěn)定而合理的狀態(tài)了,比如,襯管是否潔凈,玻璃棉的位置是否合適恰當(dāng)(能否使樣品盡可能的汽化)、汽化溫度是否合適、色譜峰形是否對(duì)稱(也就是樣品與色譜柱健合相是否匹配)、附近有沒有其它色譜峰的干擾、選用什么進(jìn)樣方式(如快速進(jìn)樣還是熱針進(jìn)樣)等等因素的影響都需要考慮,如果這些因素都考慮了,按照GMP方法驗(yàn)證對(duì)于精密度的要求,同一樣品進(jìn)6針以上的RSD和配制6個(gè)樣品的定量結(jié)果RSD都能滿足小于1.5%的要求,那么這個(gè)方法用外標(biāo)法就是完全適用的,但是前面的影響因素是一定要都考慮到的,否則談?wù)撨@個(gè)方法是否適用就有失偏頗了。在做過(guò)的許多出口產(chǎn)品的定量分析方法當(dāng)中有許多是一些醫(yī)藥公司提供的比較完善而驗(yàn)證過(guò)的方法,內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)都有(他們用的都是自動(dòng)進(jìn)樣)精密度都能滿足RSD小于1.5%的要求,當(dāng)一個(gè)方法能夠滿足測(cè)試要求的時(shí)候,無(wú)論內(nèi)標(biāo)外標(biāo),都是可行的,當(dāng)然有一個(gè)分析成本和分析時(shí)間的問(wèn)題,內(nèi)標(biāo)的成本和控制溶液、樣品溶液的配制當(dāng)然要比外標(biāo)要高和麻煩一些了。而有些時(shí)候,可能受你實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有儀器和附屬設(shè)備的影響,達(dá)不到一定的要求,而還必須進(jìn)行定量分析,有時(shí)外標(biāo)的結(jié)果可能就要差一些,這時(shí),你可能就要考慮用內(nèi)標(biāo)法了,可以排除手動(dòng)進(jìn)樣的誤差、分流歧視的影響、包括一些未知因素平行誤差的影響,這時(shí)內(nèi)標(biāo)可能就顯示出它的優(yōu)勢(shì)來(lái)了。

      2、上面已經(jīng)提到當(dāng)做方法驗(yàn)證的時(shí)候,當(dāng)同一樣品配制6個(gè)樣品溶液用所選用的外標(biāo)法進(jìn)行定量的時(shí)候,RSD都滿足1.5%的要求時(shí),也分為兩種情況,小于1%和大于1%小于1.5%。如果RSD的結(jié)果小于1%,那這個(gè)方法就沒有什么可以懷疑的了;如果RSD的結(jié)果大于1%而在1.5%略低一些的范圍活動(dòng)時(shí),這個(gè)方法的可行性就將受到質(zhì)疑,畢竟這是方法驗(yàn)證,你就要考慮上面1所提到的影響因素的影響了,如果排除掉以上的影響因素,RSD還是在1.5%附近,就要嘗試內(nèi)標(biāo)了,如果內(nèi)標(biāo)結(jié)果的RSD很好,就證明你的這個(gè)方法受實(shí)驗(yàn)條件的影響很大,只能用內(nèi)標(biāo)了,或者干脆將原方法做大的變動(dòng),再嘗試用外標(biāo)法測(cè)試。

      3、而對(duì)于微量分析,比如農(nóng)藥和獸藥殘留的分析、環(huán)境分析等,根據(jù)不同的限量標(biāo)準(zhǔn)要求對(duì)于精密度的要求也比常量分析的要求要寬松的多,RSD有時(shí)可以允許達(dá)到10%甚至更高,這時(shí)可能外標(biāo)法有更大的應(yīng)用空間。

      4、單從精密度方面去考慮,排除其它成本和效率的因素,個(gè)人認(rèn)為還是內(nèi)標(biāo)優(yōu)于外標(biāo)。曾經(jīng)做過(guò)一個(gè)中間體二氨基丙醇的常量定量分析,以二乙醇胺為內(nèi)標(biāo),RTX-5 amine(堿改性) 15m*0.32mm*1.0um色譜柱分析,將配制好的控制溶液(含有內(nèi)標(biāo)物)自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)6針,目的物(二氨基丙醇)與內(nèi)標(biāo)物(二乙醇胺)峰面積比率的RSD為0.18%,而只對(duì)這六針樣品的目的物峰(二氨基丙醇)面積求RSD,結(jié)果為0.71%,通過(guò)這一實(shí)例的結(jié)果大家就會(huì)發(fā)現(xiàn)到底哪個(gè)方法精密度更好了,當(dāng)然是內(nèi)標(biāo)更好了。當(dāng)然這個(gè)化合物的檢測(cè)方法最后根據(jù)上面的驗(yàn)證數(shù)據(jù)用內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)定量都是可以的,實(shí)驗(yàn)室可以自由選擇。但內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)精密度結(jié)果的差異是顯然存在的事實(shí)。

      結(jié)論:應(yīng)用外標(biāo)法能夠滿足要求,首選還是外標(biāo)法了,畢竟簡(jiǎn)單而省事。對(duì)于精密度要求比較高、結(jié)果準(zhǔn)確度會(huì)產(chǎn)生重大影響、實(shí)驗(yàn)室條件不是很理想的等等條件下,用內(nèi)標(biāo)法還是必要的。無(wú)論應(yīng)用那種方法,方法的驗(yàn)證和確認(rèn)都是很重要的,只要是按照程序經(jīng)過(guò)驗(yàn)證和確認(rèn)的方法,都有其應(yīng)用的空間的。

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